Uji Batas Mikroba

UJI BATAS MIKROBA

Uji batas mikroba dilakukan untuk memperkirakan jumlah aerob viable didalam semua jenis perbekalan farmasi, mulai dari bahan baku hingga sediaan jadi dan untuk menyatakan perbekalan farmasi tersebut bebas dari spesies mikroba tertentu. Otomatisasi dapat digunakan sebagai pengganti uji yang akan disajikan dengan ketentuan bahwa cara tersebut sudah divalidasi sedemikian rupa hingga menunjukkan hasil yang sama atau lebih baik.

Selama menyiapkan dan melaksanakan pengujian, spesies harus ditangani secara aseptic, jika dinyatakan lain jika disebut “ inkubasi “, maka yang dimaksud adalah menempatkan wadah didalam ruangan terkendali secara termostatik pada suhu antara 30⁰ dan 35⁰ selama 24 hingga 48 jam. Istilah “ tumbuh “ ditujukan untuk pengertian adanya dan kemungkinan adanya perkembangan mikroba viable.

UJI PENDAHULUAN

Validasi hasil uji yang akan disajikan disini dalam banyak hal berdasarkan pada ketentuan yang menunjukkan bahwa specimen uji tidak menghambat pertumbuhan mikroba yang terdapat dalam specimen uji itu sendiri. Jadi sebagai uji pendahuluan dilakukan inkulasi secara terpisah enceran specimen uji dengan biakan viable yang terdiri dari Staphylococcus aureus, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa dan salmonella.

            Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1 ml dari tidak kurang enceran 10^-3 biakan mikroba berumur 24 jam kepada enceran pertama specimen uji ( dalam dapar posfat pH 7.2, media fluid soybean- casein digest atau media fluid laktosa medium) dan diuji sesuai prosedur. Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba dimedia bersangkutan maka pengujian tersebut dinyatakan tidak berlaku dan diperlukan modifikasi prosedur dengan :

§  Meningkatkan volume pengencer dengan tetap mempertahankan jumlah bahan uji , atau

§  Menambahkan zat inaktivator dengan jumlah secukupnya kedalam pengencer, atau

§  Suatu modifikasi (1) dan (2) sedemikian rupa hingga terdapat pertumbuhan inokulum

Bahan berikut ini adalah contoh dan konsentrasi zat yang dapat ditambahkan ke dalam media untuk menetralkan zat penghambat yang terdapat didalam contoh, yaitu lesitin kedelei 0.5 % dan polisorbat 20  4 % sebagai alternative , ulangi pengujian menggunakan media fluidcasein digest – soybean lecithin – polysorbate 20 untuk menurunkan netralisasi pengawet atau bahan anti mikroba lainnya didalam contoh.

 Jika zat penhambat terdapat didalam sediaan dan dapat larut, dapat digunakan prosedur yang divalidasi dan sesuai dengan prosedur uji menggunakan penyaringan membrane  yang tertera pada uji sterilitas.

Jika penambahan inaktivasi dan peningkatan volume seperti disebut diatas masih tidak dapat menumbuhkan mikroba viable dan jika contoh tidak cocok diuji dengan cara penyaringan membrane maka dapat disimpulkan bahwa kegagalan isolasi mikroba disebabkan oleh daya bakterisida dari sediaan.

 Informasi dapat berguna untuk menunjukkan bahwa contoh tidak dapat dikontaminasi oleh jenis mikroba yang digunakan. Pemantauan perlu dilanjutkan untuk menetapkan besarnya daya hambat dan daya bakterisida dari bahan tersebut.

Larutan Dapar dan Media

            Media biakan dapat dibuat seperti disebut dibawah ini / media biakan dehidrat dapat digunakan jika setelah direkontruksi sesuai petunjuk produsen / distributor memiliki bahan yang sebanding dan atau menhasilkan media yang sama dengan media yang menggunakan formula seperti disebut dibawah ini.

            Pada pembuatan media yang menggunakan formula yang tersebut dibawah ini, larutkan bahan padatyang dapat larut dalam air, jika perlu panaskan hingga larut sempurna dan tambahkan larutan HCl atau NaOH secukupnya hingga diperoleh media dengan pH yang diinginkan, jika sudah siap digunakan tetapkan pH pada suhu 25⁰±2⁰.

            Jika pada formula disebut agar, gunakan agar dengan kadar air tidak lebih dari 15% dan jika disebut air maka gunakan air murni.

Larutan Dapar Posfat Ph 7,2

            Larutkan 34 g kalium posfat monobasa P dalam 500 ml air dalam labu tentukur – 1000 ml, tambahkan ±175ml NaOH 1 N hingga pH 7,2 ± 0,1. Tambahkan air sampai tanda dam campur, masukkan dalam beberapa wadah dan sterilkan. Simpan dalam lemari pendingin.

Sebelum digunakan encerkan 1 bagian larutan dengan 800 bagian air dan sterilkan.

 Media

            Jika tidak dinyatakan lain, media harus disterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf. Waktu paparan tergantung pada volume yang disterilkan .

Media FCDLSP (fluid casein digest – soy lecithin – polysorbate 20 medium).

Digesti pankreatik kasein P                           20 g

Lesitin kedele                                                 5   g

Polisorbate 20 p                                              40 ml

Air                                                                   960 ml

            Larutkan digesti pankreatik kasein P dan lesitin kedele dalam 960 ml air,panaskan dalam tangas air pada suhu 48 sampai 50⁰C selama kurang lebih30 menit hingga larut. Tambahkan 40 ml polisorbate 20 p , campur dan masukkan dalam wadah sesuai yang dikehendaki.

Media SCDA ( soybean – casein digest agar medium )

Digesti pankreatik kasein p                            15 g

Digesti papaiktepung kedele p                       5   g

Natrium klorida p                                           5   g

Agar p                                                             15 g

Air                                                                   1000 ml

            pH setelah sterilisasi 7.3 ± 0.2

Media FSCD (Fluid Soybean Casein Digest medium)

            Siapkan seperti pembuatan Soybean casein digest Medium seperti yang tertera pada uji sterilitas

Media MSA ( Mannitol – Soybean Agar medium)

Digesti pankreatik kasein p                            5  g

Digesti papaiktepung kedele p                       5  g

Ekstrak daging p                                             1 g

D – Manitol p                                                             10 g

Natrium klorida P                                           75 g

Agar P                                                             15 g

Merah fenol P                                                 0.025 g

Air                                                                   1000 ml

            Campur, panaskan sambil sering dikocok, dan didihkan selama 1 menit hingga melarut.

            pH setelah sterilisasi 7.4 ± 0.2.

Media BPA ( Baird- Parker Agar Medium )

Digesti pankreatik kasein p                            10  g

Ekstrak daging p                                             5    g

Ekstrak Ragi P                                                            1 g

Litium Klorida P                                            5 g

Agar P                                                             20 g

Glisin P                                                           12 g

Natrium piruvat P                                           10 g

Air                                                                   950 ml

            Panaskan sambil sering dikocok, dan didihkan selama 1 menit. Sterilkan , dinginkan sampai suhu antara 45 dan 50⁰C.dan tambahkan 10 ml larutankalium telurit P steril (1 dalam 100 ) dan 50 ml emulsi kuning telur. Campur secara hati-hati dan tuang perlahan kedalam cawan. Emulsi kuning telur telah dibuat sebagai berikut :  Disinfeksi seluruh permukaan telur, Pecahkan telur secara aseptic, dan pisahkan kuning telur seutuhnya kedalam gelas ukur berskala yang steril.  Tambahkan larutan Natrium Klorida P 0,9 % steril hingga diperoleh perbandingan kuning telur : larutan Natrium Klorida 3 : 7. masukkan kedalam blender sterildan campur dengan kecepatan tinggi selama 5 detik

            pH yang didapatkan setelah sterilisasi 6.8 ± 0.2.

Media VJA (Vogel – Johnson Agar Medium )

Digesti pankreatik kasein p                            10  g

Ekstrak Ragi P                                                            5 g

Manitol p                                                        10 g

Litium Klorida P                                            5 g

Kalium fospat dibasa                                     5 g      

Glisin P                                                           10 g

Agar p                                                             16 g

 Merah fenol P                                                            25 ng

Air                                                                   1000 ml

             Didihkan bahan padat yang telah dilarutkan selama 1 menit. Sterilkan , dinginkan hingga suhu antara 45 dan 50⁰C dan tambahkan 20 mllarutan kalium telurit Psteril (1 dalam 100 )

            pHsetelah sterilisasi 7.2 ± 0.2.

Media CETA ( Centrimide Agar Medium )

Digesti Pankreatik gelatin                              20 g

Magnesium klorida P                                     1.4 g

Kalium Sulfat P                                              10 g

Agar P                                                             13.6 g

Setil Trimetil ammonium bromide P            0.3 g

Gliserin P                                                        10 ml

Air                                                                   1000 ml

            Larutkan bahan padatdidalam air dan tambahkan gliserin P. Panaskan sambil sering dikocok dan didihkan selama 1 menit hingga larut.

            pH setelah sterilisasi 7.2 ± 0.2.

Media PAF (Pseudomonas Agarmedium for detection of flourescin )

Digesti pankreatik kasein P                           10 g

Digesti peptic jaringan hewan P                    10 g

Kalium posfat dibasa anhidrat                       1,5 g

Magnesium sulfat P (MgSO₄. 7H₂O)             1,5 g

Gliserin P                                                        10 g

Agar P                                                             15 g

Air                                                                   1000 ml

            Larutkan semua bahan padat didalam air sebelum ditambah gliserin P. Panaskan sambil  sering dikocok , dan didihkan selama 1 menit hingga larut.

            pH setelah sterilisasi 7.2 ± 0.2.

Media PAP (Pseudomonas Agar Medium for Detection Pyocianin )

Digesti pankreatik kasein P                           20 g

Magnesium Klorida anhidrat                         1,4 g

Kalium Sulfat anhidrat                                   10 g

Gliserin P                                                        10 g

Agar P                                                             15 g

Air                                                                   1000 ml

            Larutkan semua bahan padat didalam air sebelum ditambah gliserin P. Panaskan sambil  sering dikocok , dan didihkan selama 1 menit hingga larut.

            pH setelah sterilisasi 7.2 ± 0.2.

Media FLM ( Fluid Lactose Medium )

Ekstrak daging P                                            3 g

Digesti pankreatik kasein P                           5 g

Laktosa P                                                        5 g

Air                                                                   1000 ml

            Dinginkan sesegera mungkin setelah sterilisasi

            pH setelah sterilisasi 6,9 ± 0.2

Media FSCM ( Fluid Selenite – Cystine medium )

Digesti pankreatik kasein P                           5 g

Laktosa P                                                        4 g

Natrium Posfat                                               10 g

Natrium selenit asam                                                 4 g

L- sistin P                                                       10 mg

Air                                                                   1000 ml

            pH akhir  7.2 ± 0.2.

            Campur dan panaskan hingga larut. Panaskan didalam uapair mengalir selama 15 menit. Tidak boleh disterilkan.

Media FTM (Fluid tethrationate Medium )

Digesti pankreatik kasein P                           10 g

Digesti peptic jaringan hewan P                    10 g

Garam empedu P                                            1  g

Kalsium karbonat P                                        10 g

Natrium tiosulfat P                                         30 g

Air                                                                   1000 ml

            Didihkan larutan bahan padat,pada hari penggunaan tambahkan larutan yang dibuat dengan melarutkan 5 g Kalium iodide P, dan 6 g iodium P didalam 20 ml air. Kemudian tambahkan10 ml larutan hijau berlian P(1 dalam 1000) dan campur. Media tidak boleh dipanaskan sesudah penambahan larutan hijau berlian .